ABSTRACT
El objetivo del estudio fue realizar la caracterización bioinformática, así como optimizar la producción de L-asparaginasa extracelular de Bacillus sp. M62 aislada de las salinas de Maras (Cusco). Para ello, se verificó la producción de L-asparaginasa mediante el viraje del medio M9 modificado con azul de bromofenol 0.0075%, pH 7.4 a 37 °C por 72 h. A la vez, se extrajo el ADN genómico para amplificar los genes ribosómicos 16S y el gen ansA3. La secuencia aminoacídica codificada por el gen ansA3 se predijo mediante análisis bioinformático. La producción de L-asparaginasa intracelular y extracelular se evaluó a diferentes niveles de glucosa, L-asparagina, NaCl y pH en el medio M9 modificado. Adicionalmente, las actividades enzimáticas de L-asparaginasa y L-glutaminasa se determinaron mediante cuantificación del amonio liberado por el método de Nessler. Así, Bacillus sp. M62 produjo el viraje del medio M9 modificado, obtuvo alta similitud y cercanía evolutiva con Bacillus licheniformis, se encontró que el gen ansA3 amplificado codificaba para 319 aa, dentro de la cual se predijo una secuencia patrón del sitio activo (GFVITHGTDTM ) y 15 sitios inmunogénicos. La producción de L-asparaginasa extracelular fue superior a la intracelular, la que se optimizó de 0.37 U/mL (0.24 U/mg) a 2.15 ± 0.39 U/mL (0.63 U/mg). Finalmente, se encontró que Bacillus sp. M62 presenta L-asparaginasa extracelular con mínima actividad de L-glutaminasa.
The aim of this study was to perform bioinformatics characterization and optimize the production of extracellular L-asparaginase from Bacillus sp. M62, isolated from the Maras salt ponds (Cusco). To achieve this, the production of L-asparaginase was verified by the change in color of modified M9 medium, containing 0.0075% bromophenol blue, at pH 7.4 and 37°C for 72 hours. Genomic DNA was extracted to amplify the 16S ribosomal genes and the ansA3 gene. The amino acid sequence encoded by the ansA3 gene was predicted using bioinformatic analysis. The production of intracellular and extracellular L-asparaginase was evaluated at different levels of glucose, L-asparagine, NaCl, and pH in modified M9 medium. Additionally, the enzymatic activities of L-asparaginase and L-glutaminase were determined by quantifying the released ammonium using the Nessler method. Bacillus sp. M62 showed the change in color of the modified M9 medium, high similarity, and evolutionary closeness to Bacillus licheniformis. The amplified ansA3 gene was found to encode for 319 amino acids, with a predicted active site pattern (GFVITHGTDTM) and 15 immunogenic sites. The production of extracellular L-asparaginase was found to be higher than intracellular L-asparaginase and was optimized from 0.37 U/mL (0.24 U/mg) to 2.15 ± 0.39 U/mL (0.63 U/mg). Finally, it was found that Bacillus sp. M62 presents extracellular L-asparaginase with minimal L-glutaminase activity.
ABSTRACT
Objetivo. Caracterizar flavonoides presentes en el extracto y subextracto metanólico de las hojas de Apium graveolens var. Rapaceum, DC. "Apio-nabo". Materiales y métodos. Se elaboró un extracto y subextracto metanólico de las hojas Apium graveolens var. Rapaceum, DC. "Apio-nabo". Se determinó la solubilidad del extracto metanólico en solventes de polaridad creciente. Se detectaron los componentes químicos del extracto y subextracto metanólico mediante un tamizaje fitoquímico empleando gelatina, tricloruro férrico, reactivo de Shinoda, reactivo de Dragendorff y reactivo de Ninhidrina, entre otros. Se ejecutó cromatografía en capa fina y mediante espectroscopia UV/Vis se propuso estructuras químicas para los metabolitos tipo flavonoides presentes en el extracto y subextracto metanólico de hojas de Apium graveolens var. Rapaceum, DC. "Apio-nabo". Resultados. El extracto metanólico de hojas de Apium graveolens var. Rapaceum, DC fue soluble en solventes polares. Los metabolitos secundarios encontrados son compuestos fenólicos tipo flavonoides, taninos y alcaloides en el extracto y subextracto metanólico. Se propuso tres estructuras químicas de flavonoides a través del análisis de los espectros UV/Vis, y mediante comparación con lo publicado por TJ Mabry y Olga Lock. Conclusión. Se caracterizó la posible estructura química de tres metabolitos secundarios tipo flavona encontrados en el subextracto metanólico de hojas de Apium graveolens var. Rapaceum, DC.
Objective. To characterize flavonoids present in the methanol extract and subextract of the leaves of Apium graveolens var. Rapaceum, DC. "Celery-turnip". Materials and methods. An methanolic extract and subextract of Apium graveolens var. Rapaceum, DC. "Celery-turnip" was prepared. The solubility of the methanolic extract in solvents of increasing polarity was determined. The chemical components of the methanolic extract and subextract were detected by means of a phytochemical screening using gelatin, ferric trichloride, Shinoda reagent, Dragendorff reagent and Ninhydrin reagent, among others. Thin layer chromatography was carried out and by means of UV / Vis spectroscopy chemical structures were proposed for the flavonoid metabolites present in the methanolic extract and subextract of Apium graveolens var. Rapaceum, DC. "Celery-turnip". Results. It was determined that the methanolic extract of the leaves of Apium graveolens var. Rapaceum, DC. is soluble in polar solvents. The metabolites, the phenolic compounds, the flavonoids, the tannins and the alkaloids in the extract and methanol subextract. Flavonoid chemical structures are proposed through the analysis of the UV / Vis spectra, and it has been published with TJ Mabry and Olga Lock. Conclusion. The possible chemical structure of three secondary flavone metabolites found in methanolic subextract of leaves of Apium graveolens var. Rapaceum, DC.